Vinaora Nivo SliderVinaora Nivo SliderVinaora Nivo SliderVinaora Nivo Slider

Изучение бифидогенного действия лактулозы

В ПНИЛ медицинской цитологии Российской медицинской академии последипломного образования МЗ РФ проведено экспериментальное изучение бифидогенного действия лактулозного сиропа, выпускаемого под торговой маркой Лактусан.

ПНИЛ мед. цитологии Российской мед. академии последипломного образования Мин.здравоохранения РФ

Э.Г. Щербакова заведующая ПНИЛ медицинской цитологии, заслуженный деятель науки РФ, профессор

Изучение бифидогенного действия сиропа Лактусан

ЦЕЛИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. В экспериментах in vitro изучить влияние препарата Лактусан на рост бифидобактерий (производственный штамм В.bifidum I).

2. На модели ампициллин- и тетрациклин- индуцированного дисбактериоза у мышей изучить влияние Лактусана на:

- содержание бифидо- и лактобактерий;

- морфологию слизистой оболочки толстой кишки;

- морфологическое состояние печени.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы:

1. сироп Лактусан, содержащий 40% лактулозы, 16% других углеводов (12% лактозы и 4 % галактозы) и 1 % золы;

2. бифидобактерии производственного штамма Bifidobacterium bifidum l (препарат бифидум-бактерин производства ТОО "Фермент");

3. антибиотики - ампициллин натриевая соль, тетрациклин;

4. мыши линии Fl (CBA/lac x BL/6) массой тела 20 г;

5. биологический материал (печень, кишечник, фекалии, кровь) от мышей.

При бактериологическом исследовании in vitro Лактусан применяли в виде 2,5%-0,000025%-ном растворов (концентрации лактулозы 10-0,1 мкг/мл соответственно) в полужидкой среде Блаурокка или изотоническом 0,9%-ном растворе хлорида натрия. Бифидумбактерин растворяли в жидкой среде Блаурокка из расчета 1 мл на 1 дозу препарата и добавляли по 0,5 мл полученной микробной взвеси в ряд пробирок, содержащих Лактусан в указанных концентрациях в той же среде. В контрольные образцы вносили аналогичное количество бифидобактерий в среде Блаурокка без Лактусана. Контрольные и опытные образцы инкубировали в анаэростате в течение 48-72 часов при температуре 37°С, после чего проводили раститровку выросшей культуры в полужидкой среде Блаурокка общепри-нятым методом.

Выборочно из разных разведений бифидобактерий перед посевом делали контрольные мазки на стекле и микроскопировали их при окраске метиленовым синим. После инкуба-ции был проведен просмотр мазков из 50 посевов, в которых визуально зарегистрирован рост культуры.

Эксперименты in vitro по изучению влияния Лактусана на микрофлору и слизистую оболочку кишечника, а также на состояние печени проведены на 100 мышах Fl (СВА/С57ВL6) массой тела 18-20 г.

Модель медикаментозной патологии воспроизводили путем интрагастрального введения ампициллина в дозах 350-700 мг/кг или тетрациклина в дозе 750 мг/кг, ежедневно в течение 7 дней.

Лактусан вводили интрагастрально, в виде 20-0,15% раствора в 0,25 мл физиологического 0,9%-ного раствора хлорида натрия, при этом дозы лактулозы составляли соответственно 1000-7,5 мг/кг.

Курс одновременного применения Лактусана с антибиотиком составлял 7 дней. В отдельной серии экспериментов Лактусан вводили в течение 14 дней (7 дней на фоне тетрациклина и в течение последующих 7 дней).

Материал для исследования брали через 24 ч после последнего введения испытуемого препарата, сразу после забоя животных декапитацией.

Отрезки проксимальных отделов толстой кишки и кусочки печени, взятые от животных, фиксировали в 10% нейтральном растворе формалина и заливали в парафин.

Гистологические исследования проводили на срезах толщиной 5 мкм, окрашенных гематоксилин-эозином, альциановым синим, гематоксилином Эрлиха и эозином, а также пирофуксином по Ван-Гизону.

Активность лизоцима в сыворотке крови определяли микробиологическим чашечным методом (Каграманова К. А., Ермольева З.Б. 1964).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Изучение влияния Лактусана на бифидо- и лактобактерии in vitro

Растворы Лактусана с концентрациями лактулозы в 100-10 мкг/мл оказывали выраженное бифидогенное действие, увеличивая содержание бифидобактерий на 5-6 lg по сравнению с контролем. При использовании растворов Лактусана с концентрациями лактулозы 1-0,1 мкг/мл наблюдали нарастание количества бифидобактерий на 3-4 lg. Присутствие лактулозы в концентрациях 10 мг/мл и выше в среде культивирования бифидобактерий приводило к выраженному газообразованию.

Таким образом, бифидогенное действие лактулозы в сиропе Лактусан максимально выражено при ее концентрациях 100-10 мкг/мл.

Изучение влияния Лактусана на макроорганизм и его микрофлору

Для изучения эффектов Лактусана in vitro нами использованы две экспериментальные модели лекарственной патологии, вызванной пероральным применением больших доз ампициллина и тетрациклина. Это обусловлено тем, что оба антибиотика в высоких концентрациях обнаруживаются в желчи, тетрациклин в значительных количествах (20-50%) выделяется с калом. В связи с этим, к основным проявлениям побочного действия этих антибиотиков на организм относятся дисфункции пищеварительного тракта и дисбактериоз, а тетрациклин при его применении в высоких дозах может оказывать гепатотоксический эффект.

 

А. Бифидогенные эффекты Лактусана in vivo

В модельных экспериментах на животных, которым вводили антибиотики, была четко прослежена зависимость бифидогенного эффекта Лактусана от его дозы.

Ампициллин-индуцированный дисбиоз.

Ампициллин в дозе 350 мг/кг после 7-дневного перорального применения существенно не влиял на содержание бифидобактерий в пищеварительном тракте мышей, которое оставалось на уровне интактного контроля (109 КОЕ/г). Не было выявлено угнетения кишечной бифидофлоры также и после введения ампициллина в течение еще 4 дней на фоне голодания. При одновременном применении с ампициллином лактулоза в составе Лактусана оказывала выраженный бифидогенный эффект в очень широком диапазоне доз - от 7,5 до 1000 мг/кг. Оптимальное повышение содержания бифидобактерий (до 1013 KOE/г, т.е. на 4-6 lg выше, чем у интактных животных) было достигнуто при применении лактулозы в дозах от 7,5 до 125 мг/кг.

Лактулоза в дозах 250-1000 мг/кг обеспечивала менее выраженную стимуляцию роста бифидобактерий, но их уровень оставался на 2-3 lg выше контрольного. Однако, у мышей, получавших 1000 мг/кг лактулозы, отмечено появление жидкого стула.

Ампициллин вызывал угнетение роста лактобактерий, о чем свидетельствует снижение их содержания на 2 порядка (до 104-5 КОЕ/г при 106-7 КОЕ/г у интактных животных).

Стимуляция Лактусаном роста лактобактерий на данной экспериментальной модели проявлялась при всех испытанных дозах. Его применение во всех случаях предотвращало индуцированное ампициллином снижение уровня лактобактерий, а при дозах лактулозы 7,5-125 мг/кг их содержание на 3-4 lg превышало уровень у мышей, получавших только антибиотик, и было на 2 lg выше, чем в контроле.

Тетрациклин-индуцированный дисбиоз.

Тетрациклин в дозе 750 мг/кг после 7-дневного курса его применения вызвал снижение содержания бифидобактерий в фекалиях мышей на 2 lg по сравнению с интактным контролем.

Введение одновременно с тетрациклином лактулозы в дозах 125-62,5 мг/кг не только предотвращало угнетение бифидобактерий, но и обеспечивало повышение их уровня на 2-3 lg.  Важно отметить, что на этой экспериментальной модели оптимальный бифидогенный эффект (возрастание уровня бифидобактерий на 4 lg по сравнению с контролем) отмечался в группе животных, которые получали лактулозу в дозе 125 мг/кг в течение 14 дней (7 дней на фоне тетрациклина и 7 дней после его отмены). Данная схема применения Лактусана обеспечивала также повышение уровня лактобактерий не менее чем на 2 lg по сравнению с интактным контролем. У мышей этой группы отмечено также умеренное возрастание содержания лизоцима в сыворотке крови мышей - до 4 мкг/мл при 2,0-2,6 мкг/мл в контроле и у мышей, получавших только тетрациклин.

Применение на фоне тетрациклина 1,25%-ного раствора Лактусана, т.е. лактулозы в дозе 62,5 мг/кг, обеспечивало сохранность исходного уровня лактобактерий в фекалиях мышей.

 

B. Морфологические исследования.

 

1. Исследование слизистой оболочки кишечника

Ампициллиновая модель

Ампициллин в дозе 350 мг/кг интрагастрально в течение 7 дней индуцировал развитие в тонкой кишке морфологической картины умеренного токсического энтерита, который характеризовался дистрофией поверхностного эпителия кишечных ворсинок по всей их длине, лимфостазом и отеком стромы ворсинок. В толстой кишке отмечены явления мини-мального токсического колита: дистрофия поверхностных эпителиоцитов, полнокровие сосудов субэпителиальных отделов стромы и ее отек.

Применение Лактусана в оптимальной дозе лактулозы 125 мг/кг одновременно с ампициллином эффективно защищало слизистую оболочку кишечника, обеспечивая полную нормализацию ее морфологии и клеточного состава.

Тетрациклиновая модель

Под влиянием тетрациклина в слизистой оболочке тонкого кишечника наблюдали морфологические признаки токсического энтерита; выраженную вакуольную дистрофию эпителиоцитов ворсинок; большое количество межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ) в поверхностном эпителии слизистой оболочки кишки; в эпителии ворсинок выявлялось мало бокаловидных клеток и они слабо окрашивались альциановым синим, что свидетельствует об их слабой функциональной активности.

Важно отметить выявленную под влиянием антибиотика дегрануляцию клеток Панета, которые являются основными продуцентами эндогенного лизоцима и секреторных иммуноглобулинов в кишечнике млекопитающих.

В толстой кишке мышей, получавших тетрациклин, развивалась типичная морфологическая картина токсического колита. У одной мыши гистологически был выявлен криптальный абсцесс, у всех животных наблюдались дистрофические изменения эпителиоцитов, в поверхностном эпителии возрастала численность межэпителиальных лимфоцитов и бокаловидных клеток, слабо окрашенных альциановым синим.

Лактусан при его применении в течение 14 дней (7 дней на фоне антибиотика и 7 дней после его отмены) по 0,25 мл 2,5% раствора, что соответствует дозе лактулозы 125 мг/кг, эффективно препятствовал развитию указанных изменений и обеспечивал полную нормализацию морфологии слизистой оболочки тонкой и толстой кишки.

 

2. Исследование состояния печени

Выявлено защитное действие лактулозы в составе Лактусана на ткань печени, которое наиболее ярко проявлялось при тетрациклин-индуцированном лекарственном поражении.

Тетрациклиновая модель

Под влиянием тетрациклина мы наблюдали типичные проявления острого токсического медикаментозного гепатита с выраженным фиброзом большинства портальных трактов. В дольках печени отмечалось повреждение преимущественно центролобулярных и перипорталъных гепатоцитов.

Оптимальную защиту ткани печени от повреждающего действия тетрациклина обеспечила лактулоза в дозе 125 мг/кг, которую вводили в течение 7 дней на фоне антибиотика и 7 дней после его отмены. У животных этой группы морфологическая картина печеночной ткани не отличалась от таковой у интактных животных.

При применении лактулозы в дозе 62,5 мг/кг в течение 7 дней на фоне тетрациклина не обнаруживалось типичных для действия антибиотика явлений острого токсического гепатита. Выявлен жировой гепатоз различной выраженности с умеренным фиброзом большинства портальных трактов.

Таким образом, на выбранной нами модели тетрациклин-индуцированного токсического гепатита значительное протективное действие Лактусана на ткань печени проявляется лишь в дозе лактулозы, соответствующей 125 мг/кг.

Ампициллиновая модель

В отличие от тетрациклина, ампициллин не вызывал значительных повреждений ткани и клеточного состава печени мышей. Ее гистологическая структура у мышей, получавших ампициллин, практически не отличались от таковой у интактных животных. Отмечено лишь наличие умеренного фиброза отдельных портальных трактов.

У большинства животных, получавших на фоне ампициллина лактулозу в дозах от 31,25 до 125 мг/кг, морфологическая картина ткани печени была близка к таковой в контроле. Наблюдалось некоторое увеличение просвета центральных вен и печеночных вен портальных трактов. В ряде случаев на фоне легкого или умеренного фиброза отдельных портальных трактов выявлены явления минимального жирового гепатоза. При использовании 5%-ного раствора Лактусана (доза лактулозы 250 мг/кг) явления фиброза были более выражены.

Наилучшее защитное действие лактулоза в составе Лактусана оказывала в дозе 125 мг/кг, т.е. 300 мг/кг Лактусана.

 

ВЫВОДЫ

  1. 1.   Концентрат лактулозы Лактусан обладает выраженным бифидогенным действием, стимулируя рост бифидобактерий in vitro и in vivo.
  2. 2.   Бифидогенный эффект Лактусана проявляется в широком диапазоне доз. Оптимальный бифидогенный эффект in vitro оказывают 0,025% и 0,0025% растворы Лактусана, что соответствует концентрациям лактулозы 100 и 10 мкг мл. Выраженная стимуляция бифидо- и лактофлоры у мы шей на модели дисбиоза, индуцирован-ного ампициллином или тетрациклином, проявляется при применении Лак тусана по 0,25 мл 2,5-0,15% растворов, что соответствует дозам лактулозы 125-7,5 мг/кг.
  3. 3.   Лактусан оказывает дозозависимый протективный эффект на ткань печени и слизистую оболочку кишечника, предотвращая побочное токсическое действие высоких доз тетрациклина и ампициллина. Лактусан в виде 2,5%-ного раствора (доза лактулозы 125 мг/кг) оказывал выраженное защитное действие на ткань печени, слизистую оболочку тонкой и толстой кишки при его одновременном применении с высокими дозами ампициллина и тетрациклина.
  4. 4.   Максимальный эффект Лактусана получен при введении лактулозы в дозе 125 мг/кг в течение 14 дней (7 дней на фоне тетрациклина и 7 дней после отмены антибиотика). Применение Лактусана по этой схеме обеспечивало наибольшее возрастание содержания бифидо- и лактобактерий, полностью предотвращало развитие индуци-рованных тетрациклином токсических поражений печени и слизистой оболочки кишечника.
  5. 5.   Выявлена перспективность и целесообразность продолжения экспериментального изучения свойств Лактусана и механизмов их реализации, поиска путей усиления его пробиотических и гепатопротективных эффектов с целью разработки оптимальных условий его использования в медицинской практике для профилактики и лечения алкогольных, медикаментозных и других поражений пищеварительного тракта и гепатобилиарной системы.
    1. 6.     Результаты проведенных исследований позволяют рекомендовать применение    

 Лактусана детском и геродиетическом питании.

Additional information